Сигналізація через Tyr985 рецептора лептину як перемикача, що залежить від віку в регулюванні

  • Знайдіть цього автора на Google Scholar
  • Знайдіть цього автора на PubMed
  • Шукайте цього автора на цьому сайті
  • Для листування: liuy @ sibs.ac.cncai_li @ merck.com

АНОТАЦІЯ

Лептин регулює енергетичний гомеостаз за допомогою центральної активації безлічі сигнальних шляхів, опосередкованих Ob-Rb, довгою формою рецептора лептину. Резистентність до лептину лежить в основі патогенного розвитку ожиріння, яке тісно пов'язане з факторами навколишнього середовища. Для подальшого розуміння фізіологічної функції сигнальних механізмів лептину ми створили лінію мишей (Y985F), що експресує мутантний Ob-Rb із заміною фенілаланіну на Tyr 985, один з трьох внутрішньоклітинних тирозинів, які опосередковують сигнальну дію лептину. Дивно, але тоді як молоді гомозиготні тварини Y985F були трохи худішими, вони демонструють ожиріння у дорослих або через дієту. Важливо, що як вікове, так і індуковане дієтою погіршення енергетичного балансу було паралельно із вираженою стійкістю до лептину, що значною мірою пояснювалось послабленням активізації гіпоталамусу STAT3, що реагує на лептин, а також помітно підвищеною експресією гіпоталамусу SOCS3, ключового негативного регулятора лептину сигналізації. Таким чином, ці результати розкривають різні бінарні ролі для опосередкованого Try 985 сигналізації в енергетичному метаболізмі, діючи як регуляторний перемикач, що залежить від віку/дієти, для протидії ожирінню, пов’язаному з віком або дієтою.

лептину

Щоб отримати подальше розуміння ролі внутрішньоклітинного фосфорилювання Ob-Rb у опосередкуванні фізіологічних функцій лептину in vivo, ми раніше створили дві лінії мишей, що експресують мутантні рецептори лептину із заміною фенілаланіну для всіх трьох тирозинів або лише для Tyr 1138, виявляючи метаболічний внесок як тирозин-залежних, так і -незалежних дій в енергетичному гомеостазі (26). Тут ми досліджували фізіологічні наслідки відміни передачі сигналів через Ob-Rb Tyr 985 шляхом характеристики збитих мишей, породжених введенням замісної мутації фенілаланіну на цій ділянці. Ми дослідили вплив дефіциту опосередкованого Tyr 985 сигналізації на сприйнятливість мишей до енергетичного дисбалансу, пов'язаного з віком та індукованим дієтою, намагаючись дослідити потенційні механістичні зв'язки між стійкістю до лептину та впливами навколишнього середовища, такими як старіння та переїдання.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Покоління мишей, що вбиваються Y985F. Стратегія генетичного націлювання для генерації нокаутованих мишей (Y985F), що експресують мутантний рецептор лептину Ob-Rb F985, була проведена в Центрі трансгенних технологій UTSW, як було детально описано раніше (26). Коротко кажучи, вектор націлювання був побудований шляхом введення Lox-Neo-Lox (LNL), гена стійкості до неоміцину, фланкуваного до Lox, нижче від мутантного екзону 18 гена Ob-Rb, який містить цільову мутацію заміщення на Tyr 985 (рис. . 1А). Стабільні гомологічні рекомбінантні клони були відібрані з G418 із 129/Sv ембріональних стовбурових клітин (ES), трансфікованих цільовою ДНК-конструкцією, з подальшим підтвердженням заміщення Tyr-to-Phe шляхом аналізу послідовності ПЛР-ампліфікованих екзонових 18-фрагментних фрагментів ДНК . Бластоцисти, яким вводили підтверджені ES-клони, згодом передавали псевдо вагітним самкам для отримання химерних мишей агуті, а успішне націлювання на гени було додатково підтверджено блотерінгом Саузерн. Мишей, які передавали зародкові лінії, схрещували з мишами протаміну-Кре, видаляючи касету для відбору LNL лише з чоловічої зародкової лінії.

Фенотиповий аналіз. Загальний жир в організмі вимірювали за допомогою ядерно-магнітного резонансу (ЯМР) за допомогою аналізатора Minispec Mq7.5 (Брукер, Німеччина). Споживання їжі визначали на мишах, що знаходились в клітці, зважуючи їжу щодня перед темним циклом протягом 5-10 днів. Швидке (6-годинне голодування, з 8:30 до 14:30 вечора) відбирали кров з хвостової вени, а глюкозу вимірювали за допомогою глюкометра (FreeStyle, Alameda, CA). Рівні інсуліну та лептину аналізували за допомогою мишачої сироватки Adipokine LINCOplex Kit (Linco Research, St. Charles, MO) за допомогою системи Bio-Plex (Bio-Rad, Геркулес, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника.

Швидкість метаболізму та фізичні навантаження. Споживання кисню та фізичну активність визначали для тварин, які годувались за бажанням, за допомогою комплексної лабораторної системи моніторингу тварин (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH) відповідно до інструкцій виробника. Мишам давали можливість акліматизуватися в системі протягом 16-20 годин, а поглинання кисню (VO2) вимірювали протягом наступних 24 годин. Добровільну активність контролювали за допомогою розривів променів осі х, що збиралися кожні 15 хв.

Аналіз чутливості до лептину in vivo. Самцям мишей у віці 7 або 40 тижнів ін'єктували внутрішньочеревно (ip) двічі на день (о 8:30 ранку та 6:00 вечора) забуференний фосфатом сольовий розчин (PBS) або рекомбінантний лептин миші (Національна програма з гормонів та пептидів, UCLA, Торранс, Каліфорнія) (1 мг/кг/добу для 7-тижневих мишей та 2,5 мг/кг/добу для 40-тижневих мишей). Спочатку мишам вводили PBS протягом 3 днів, потім ін’єкцію лептину протягом 3-4 днів, як вказано, а потім ін’єкцію PBS протягом ще 2 днів. Під час лікування щодня контролювали масу тіла та споживання їжі.