Специфічний для міофібробластів YY1 сприяє розвитку фіброзу печінки

Хуан Лю

Інститут серцево-судинних захворювань Aab, Медичний факультет, Університет Рочестера, Школа медицини та стоматології, Рочестер, Нью-Йорк, США

b Ключова лабораторія збереження та підтримки родючості Міністерства освіти, Департамент біохімії та молекулярної біології, Школа основних медичних наук, Медичний університет Нінся, Іньчуань, Китай

Шуя Чжан

Суовен Сю

Марина Корольова

Ерік М. Малий

Чжен генерал Цзінь

HL, SZ та ZGJ написали рукопис з коментарями та внесками від усіх авторів. HL, SZ та MK проводили експерименти. SX виправив і переглянув рукопис. EMS надала ключові реагенти. ZGJ задумав дослідження. Усі автори схвалили остаточну версію рукопису.

Пов’язані дані

Анотація

Фіброз печінки є загальним наслідком різних хронічних гепатитів та травм печінки. Міофібробласти через накопичення білків позаклітинного матриксу (ECM) тісно пов’язані з прогресуванням фіброзу печінки. Однак молекулярні механізми, що лежать в основі транскрипційної регуляції фіброгенних генів та білків ECM у міофібробластах, залишаються в основному невідомими. Використовуючи індуковані тамоксифеном міофібробласт-специфічні Cre-експресуючі лінії мишей із селективною делецією фактора транскрипції Yin Yang 1 (YY1), ми показуємо, що делеція YY1 в міофібробластах пом'якшує індукований тетрахлоридом вуглецю фіброз печінки. Цей захисний ефект абляції YY1 на фіброз печінки супроводжувався зниженою експресією профіброгенних генів та білків ECM, включаючи TNF-α, TGF-β, PDGF, IL-6, α-SMA та Col1α1 в тканинах печінки від мишей-мутантів YY1. Більше того, використовуючи зоряну клітину печінкової клітини людини (HSC) лінії LX-2, ми виявили, що нокдаун YY1 в міофібробластах за допомогою обробки siRNA зменшує проліферацію міофібробластів, експресію α-SMA та відкладення колагену. У сукупності наші висновки виявляють специфічну роль YY1 у печінкових міофібробластах та пропонують нову терапевтичну стратегію при захворюваннях печінки, пов’язаних із фіброзом печінки.

1. Вступ

Фактор транскрипції Інь Ян 1 (YY1) відіграє вирішальну роль у різних біологічних процесах, включаючи клітинну проліферацію, диференціацію та розвиток [7]. Однак незрозуміло, чи сприяє YY1 активації міофібробластів та виробленню ECM під час розвитку фіброзу печінки. Використовуючи нещодавно сконструйовані миші, орієнтовані на ген генів рекомбінази Postn Cre (Postn MCM), для генетичної абляції YY1 у міофібробластах, ми повідомляємо, що специфічна для міофібробластів делеція YY1 інгібувала утворення міофібробластів та ослаблювала фіброз печінки у мишей, які страждали тетрахлоридом вуглецю CCL ).

2. Матеріали та методи

2.1. Миші та лікування

Для оцінки потенційного ефекту дефіциту YY1 в міофібробластах на моделі мишей, які отримували фіброз, оброблений CCL4, миші, дефіцитні міофібробластам YY1 (YY1 flox/flox, Postn MCM +), генерували шляхом схрещування мишей YY1 flox/flox [8] з мишами Postn MCM + [9]. Умовні нокаути мишей YY1 (YY1 флокс/флокс) [8] були придбані у лабораторії Джексона; Мишей Postn MCM + обдарував Джеффрі Д. Молкентін [9] (Дитяча лікарня Цинциннаті). Мишей флокс/флокс YY1 використовували в якості дитинчатого дикого типу (WT). 10-тижневий YY1 флокс/флокс; Мишей Postn MCM + годували тамоксифенною харчовою дієтою (Envigo, Cat. № TD.130857) протягом 8 тижнів CCL4 (Sigma, Cat. No 289116 2 мкл/г, розведене 1: 4 в оливковій олії (Sigma, Cat No. O1514), що вводиться один раз на день протягом п’яти днів (разом 12 разів). Через вісім тижнів мишей забивали під наркозом через 48 год після останньої дози CCL4. Усі дослідження на тваринах були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Медичний центр Університету Рочестера.

2.2. Гістологія та імуногістохімія

2.3. Експерименти з культурою клітин

Лінія зоряних клітин печінки людини (HSC) LX-2 [10] (MilliporeSigma, Cat. No. SCC064). Клітини LX-2 культивували в DMEM з високою глюкозою (Millipore Cat. No. SLM-021-B), 2% FBS (Millipore Cat. No. ES009-B), 1% Pen/Strep (Millipore Cat. No. TMS- AB2-C) та 1% глютаміну (Millipore Cat. No. TMS-002-C). Клітини LX-2 пересівали трипсином (Millipore Cat. № SM-2003-C), а потім перед використанням їх пасували. Клітини LX-2 стимулювали TGF-β (10 мкг/мл; Sigma, Cat No SAB4502958) протягом 24 годин, щоб трансформуватися в міофібробласт.

2.4. трансфекція міРНК

Для трансфекції використовували міофібробласти при злитті більше 80% у 60-мм посуді. Коротше кажучи, трансфікуючий агент RNAiMax (6 мкл; Invitrogen; Кат. No 13-778-030) змішували з Opti-MEM (250 мкл; Invitrogen; Кат. № 11-058-021), а потім siRNA людини YY1 (25 нМ, Invitrogen; Cat. No АМ16708) або нецільову контрольну siРНК (25 нМ, Invitrogen; Cat. No. AM4065), розведену в 250 мкл Opti-MEM, додавали до розчину, обережно перемішували та інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хв. . Загалом 0,5 мл цієї суміші додавали до MF в 1,5 мл Opti-MEM і інкубували протягом чотирьох годин. Потім носій замінювали повноцінним середовищем DMEM і клітини обробляли через 48 год після трансфекції [11].

2.5. Кількісна ПЛР в режимі реального часу

Після обробки загальну РНК екстрагували за допомогою набору QIAGEN RNeasy Mini (Qiagen, Cat № 74136) [11]. Концентрацію та чистоту РНК визначали за допомогою спектрофотометра Nanodrop2000 (Thermo Fischer Scientific). Для зворотної транскрипції 0,5—1 мкг загальної РНК спочатку перетворювали на ланцюг комплементарної ДНК (кДНК), використовуючи комплект для зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Applied Biosystems, Cat № 4374966), дотримуючись інструкцій виробника. Потім проводили кількісну ПЛР в реальному часі за допомогою термоциклера ПЛР у реальному часі Bio-Rad iQ5, використовуючи iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Cat. № 1708886) для відносного визначення мРНК. Всі послідовності праймерів були перераховані в таблиці S1. Метод порівняльного порогу циклу (Ct) (2 – ΔΔCt) був використаний для визначення відносної експресії мРНК цільових генів після нормалізації до господарського гена GAPDH або β-актину.

2.6. Вестерн-блот-аналіз

Заморожені тканини печінки та загальні лізати клітин збирали у свіжоприготованому буфері для лізису (20 мМ Tris-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 1 мМ ЕДТА, 1 мМ ЕГТА, 2,5 мМ пірофосфату натрію, 1 мМ β-Гліцеролфосфат, 50 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4 та 1% коктейль інгібітора протеази). Після освітлення при 4 ° C клітини відкручували при 12 000 г протягом 10 хв; загальний клітинний лізат збирали для аналізу гелю SDS-PAGE. Через 1,5 год перенесення при 250 мВ мембрани блокували в блокувальному буфері LI-COR, розведеному 1: 1 PBS при кімнатній температурі протягом однієї години. Потім ляпки інкубували з первинними антитілами (перерахованими в таблиці S2), розведеними у 3% BSA при 4 ° C протягом ночі або кімнатної температури протягом однієї години, після чого інкубували з козячим IgG козячого анти-миші LI-COR IRDye ® 680RD (H + L) або IRDye ® 800CW козячий анти-кролячий IgG (H + L) або IRDye ® 680RD осличий анти-козячий IgG (H + L) (розведення при 1: 10000) при кімнатній температурі протягом 30 хв. Зображення візуалізувались за допомогою системи інфрачервоного зображення Odyssey (LI-COR) [11]. Денситометрійний аналіз плям проводили за допомогою програмного забезпечення NIH Image J (http://imagej.nih.gov/ij/).