Тригліцериди тканин, резистентність до інсуліну та наслідки виробництва інсуліну для гіперінсулінемії

Лабораторії Гіффорда, Центр досліджень діабету, Департамент внутрішніх хвороб, Південний медичний центр Техаського університету, Даллас 75235; і

Медичний центр Департаменту у справах ветеранів, Даллас, штат Техас 75216

Анотація

Вміст тригліцеридів тканин (TG), здавалося, був правдоподібним кандидатом на цю подвійну роль. Давно відомі довголанцюгові вільні жирні кислоти (ЗЖК) перешкоджають опосередкованому інсуліном метаболізму глюкози (2, 8, 13, 15,18, 24, 25, 29) і гостро стимулюють секрецію інсуліну (5, 11, 22, 26, 31). Більше того, було показано, що високі рівні FFA in vitro індукують на нормальних острівцях ті самі зміни, що описані в компенсуючих β-клітинах ожиріння, таких як гіперплазія β-клітин та підвищена секреція інсуліну при субстимулюючому рівні глюкози (16, 26). По-третє, було показано, що острівці гіперінсулінемічних пацуків із ожирінням мають надзвичайно високий вміст TG у порівнянні зі звичайними однолітками (20).

Тварини.

На початку експериментів усі тварини були віком 7–9 тижнів. Жирні щури із цукровим діабетом Цукер (ZDF) (фа/фа) були виведені в нашій лабораторії з ZDF/Drt-фа (F10) запас придбаний у Р. Петерсона (Медичний факультет Університету Індіани, Індіанаполіс, штат Індіана) Самці щурів демонстрували описаний раніше фенотип (30).

Самців щурів Wistar, придбаних у селекційних лабораторіях Чарльз-Рівер (Вілмінгтон, штат Массачусетс), використовували в якості нежирних засобів для вільного вигодовування та обмежених дієт. Щури з обмеженим харчуванням - це щури пари Вістар, яких годували ліпопенічними щурами, що перевиробляють лептин, описаними в наступному абзаці; це призвело до зменшення загальної калорійності на 42%.

Гіперлептинемічні, ліпопенічні тварини були звичайними щурами Wistar, які отримували інфузію рекомбінантного аденовірусу, що містить кДНК лептину (AdCMV-лептин). Як повідомлялося раніше (3), мРНК лептину з'явилася в печінці у зв'язку з підвищенням рівня лептину в плазмі крові та зменшенням споживання їжі та маси тіла (див. Рис. 1). Іншій групі щурів Wistar інфузували аденовірус, що містить кДНК неактуального білка, бактеріальну β-галактозидазу (AdCMV-βGal), як контроль вірусної інфекції.

Дослідження передачі генів.

Для клонування кДНК лептину щурів та вимірювання його мРНК загальну РНК готували з 1 г епідидимальної жирової тканини щурів шляхом екстракції TRIzol за рекомендацією виробника. Oligo (dT) використовували для первинного синтезу кДНК першої ланцюга за допомогою набору для синтезу кДНК (Clontech, Пало-Альто, Каліфорнія). Після обробки кДНК першої нитки рибонуклеазою, що не містить дезоксирибонуклеази, продукт гена лептину ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) праймером 5′-GGAGGAATCCCTGCTCCAGC-3 ′ та антисмисловим праймером 5′-CTTCTCCTGAGGATACCTG 3G на послідовності гена лептину щурів (27). Як для клонування кДНК, так і для вимірювання мРНК лептину, ампліфікацію проводили за допомогою 1 циклу при 94 ° C протягом 3 хв, після чого 35 циклів при 92 ° C протягом 45 с, при 53 ° C протягом 45 с і при 72 ° C протягом 1 хв, а потім остаточне продовження при 70 ° С протягом 10 хв. Ми також вимірювали експресію β-актину з тими ж умовами ампліфікації, що і для лептину та раніше описаної пари олігонуклеотидів (23).

Для одержання рекомбінантного вірусу PR-фрагмент 640 п.н., що містить всю кодуючу область лептину, лігували до pCR TM 2.1 (Invitrogen, Сан-Дієго, Каліфорнія) згідно з протоколом виробника. Аналіз послідовності підтвердив, що кілька клонів містили інтактну кДНК лептину. AБамH I- іXba Фрагмент кДНК, обмежений I, який включав 60 bp 5 'нетранслируемой області та 76 bp 3' нетранслірованої області, лігували до аналогічно обробленого pACCMVpLpA (10). Отриману плазміду котрансфікували pJM17 (23) у 293 клітини шляхом спільного осадження фосфату кальцію/ДНК для утворення нового рекомбінантного вірусу AdCMV-лептину за допомогою раніше описаних методів (1). Виділили ДНК вірусу, а наявність вставки гена лептину підтвердили за допомогою ПЛР із використанням описаних вище праймерів та блоттингом Саузерна олігонуклеотидом (5′-GGATACCGACTGC GTGTGTGAAATGTCAT-3 ′), комплементарним кДНК лептину щурів. Запаси AdCMV-лептину посилювали та очищали, як описано (1), і зберігали при -70 ° C у забуференному фосфатом фізіологічному розчині з 0,2% бичачого сироваткового альбуміну (BSA) та 10% гліцерину при 1–3 × 10 12 одиниць, що утворюють наліт (пфу)/мл Вірус, що містить ген бактеріальної β-галактозидази під контролем промотору CMV, AdCMV-βGal, був підготовлений та використаний, як описано раніше (14).

Вірус вводили самцям щурів Wistar, отриманих із лабораторій Charles River (Wilmington, MA). Перед дослідженнями інфузії аденовірусу всі щури отримували стандартний щурячий чау (Teklad F6 8664, Медісон, Вісконсин) у вільному режимі та мали вільний доступ до води. Поліетиленові трубки (PE-50, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) були закріплені в лівій сонній артерії 9-тижневих щурів Wistar ∼ 250–300 г під анестезією на пентобарбітал натрієм (50 мг/кг, лабораторії Abbott, Північний Чикаго, Іллінойс) і екстеріоризований через підшкірний тунель. Пробірки заповнювали гепаринізованим сольовим розчином (1000 ОД/дл), поки інфузія вірусу не розпочалася через 3 дні після операції. Перед інфузією зразки аденовірусу суспендували у фізіологічному розчині та фільтрували через 0,2-мкм фільтр. Два мілілітри AdCMV-лептину або AdCMV-β-Gal, що містять загальну кількість 1 × 10 12 пфу, вводили знеболеним тваринам протягом 1 години. Тварин досліджували в окремих метаболічних клітинах (Налген, Рочестер, Нью-Йорк), а споживання їжі та масу тіла вимірювали щодня.

Вимірювання плазми.

Починаючи з 1 дня після інфузії аденовірусу, з хвостої вени в капілярні пробірки, покриті ЕДТА, відбирали зразки крові натще (1–3 вечора). Плазму зберігали при -20 ° C до моменту аналізу лептину. Плазмовий лептин аналізували за допомогою набору для аналізу лептину Linco (Linco Research, St. Charles, MO). Інсулін у плазмі крові аналізували стандартними методами (37). Глюкозу в плазмі вимірювали за допомогою аналізатора глюкози II (Бекман, Бреа, Каліфорнія).