Вплив вмісту жирних кислот у харчуванні на плечовий хрящ та структуру кістки на моделі миші
Лорен Вотава
1 Кафедра ортопедичної хірургії, Університет Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі 63110
2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110
3 Кафедра біомедичної інженерії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110
Андреа Г. Шварц
1 Кафедра ортопедичної хірургії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, Міссурі 63110
2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110
Наталя Сергіївна Гарасимович
1 Кафедра ортопедичної хірургії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, Міссурі 63110
2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110
Чіа-Лун Ву
1 Кафедра ортопедичної хірургії, Університет Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі 63110
2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110
Фаршид Гілак
1 Кафедра ортопедичної хірургії, Університет Вашингтона, Сент-Луїс, Міссурі 63110
2 дитячі лікарні - Shriners - Сент-Луїс, Сент-Луїс, MO 63110
3 Кафедра біомедичної інженерії, Вашингтонський університет, Сент-Луїс, штат Міссурі 63110
Внески автора: LV та FG розробили концепцію та розробили експерименти. Л. В. проводила експерименти. LV, AGS, NSH та CLW аналізували дані. Л. В. написав рукопис. Усі автори прочитали та схвалили остаточно поданий рукопис.
Анотація
ВСТУП
Для більш прямого вивчення механізмів, що зв’язують ожиріння та ОА, розроблені тваринні моделі ожиріння, що використовують або дієту з високим вмістом жиру 10–14, або генетичну абляцію сигналів про лептин (наприклад, мишей ob/ob або db/db). 15 Багаточисельні дослідження показали посилення тяжкості спонтанного ОА 15–17 або індукованого ОА 7,13,14 у тварин, що харчуються дієтою з високим вмістом жиру, але відсутність спонтанного ОА у мишей із ожирінням та дефіцитом лептину, які харчуються стандартною дієтою чау-чау . 15
Також є все більше доказів того, що дієтичний склад сам по собі може сприяти ОА, спричиненому ожирінням. На додаток до калорійності, є все більше доказів того, що склад раціону, зокрема вміст жирних кислот, може суттєво впливати на тяжкість ОА в суглобовій специфіці. 7,10,18,19 Наприклад, дієти з високим вмістом жиру, складені переважно насиченими жирними кислотами (SFA) або поліненасиченими жирними кислотами ω-6 (PUFA), демонструють значно гірший ОА колінного суглоба, ніж аналоги, які відповідають вазі. жирна дієта з ω-3 ПНЖК або звичайна дієта для чау-миші. 10 У цих дослідженнях було виявлено, що дієта з високим вмістом жиру, доповнена ω-3 ПНЖК, захищає коліно від ОА, спричинених травмами, тоді як дієти з високим вмістом жиру, багаті насиченими жирами та ω-6 ПНЖК, посилюють дегенерацію хряща та синовіт після травми коліна. Однак не спостерігається значного впливу підвищеного вмісту в їжі ω-3 ПНЖК на розвиток спонтанного ОА в колінному суглобі. 7,10,20
Метою цього дослідження було визначити, чи впливав вміст жирних кислот у харчуванні на виникнення спонтанних ОА та структурних змін кісток плеча у мишей із ожирінням, спричинених дієтою. Мишей годували або нежирною контрольною дієтою чау, або дієтами з високим вмістом жиру, багатими ω-3 ПНЖК, ω-6 ПНЖК або SFA. Ми припустили, що дієта, багата на PUFA ω-3, матиме захисний ефект на хрящі та кістки плеча. Кістку, хрящ та синовію головки плечової кістки аналізували на наявність пов’язаних з ОА змін за допомогою мікро-комп’ютерної томографії (MicroCT) для вивчення мікроструктури кісток, атомно-силової мікроскопії (AFM) для вивчення механічних властивостей мікромасштабу хряща та гістологічного класифікації до оцінити дегенерацію хряща та синовіальне запалення.
МЕТОДИ
Тварина модель.
Починаючи з 4-тижневого віку, самців мишей C57BL/6J годували протягом 24 тижнів або контрольною дієтою з низьким вмістом жиру (10% ккал жиру), або однією з трьох дієт з високим вмістом жиру (60% ккал жиру), багатих ω-3 ПНЖК, ω-6 ПНЖК або SFA . Ці миші були спочатку розроблені для попереднього дослідження, що досліджувало, як дієтичні жирні кислоти впливають на розвиток ОА коліна, і були повідомлені дані про вміст у їжі, вагу тіла, тяжкість ОА коліна, вимірювання цитокінів та ліпідів у сироватці крові та відповідь на загоєння рани у вусі. 7,10 Таким чином, у цьому дослідженні не використовувались живі тварини, але всі попередні процедури використання тварин були затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин. 7,10 Усі зразки зберігали при -20 ° C після евтаназії. Перед аналізом зразки розморожували при 4˚С, а голови плечової кістки ізолювали.
Аналіз MicroCT трабекулярної та коркової кісток.
Гомілкові голівки фіксували у 4% параформальдегіді протягом 24 годин при кімнатній температурі (n = 12-15 на групу дієти). Потім зразки зневоднювали в етанолі та сканували на повітрі за допомогою MicroCT (SkyScan 1176, Bruker, Billerica, MA) з роздільною здатністю 9 мкм/піксель, рентгенівською напругою 55 кВ, струмом 455 мкА, часом витримки 980 мс, 3-кратним середнім значенням кадру, а також промінна фільтрація з алюмінієвим фільтром 0,5 мм. Мінеральну щільність кісток калібрували за допомогою фантомів гідроксиапатиту (Bruker). Трабекулярні ділянки головки плечової кістки визначали як обсяг між субхондральною кістковою пластинкою та проксимальною пластиною росту. Кожну область аналізували за допомогою розширення BoneJ у ImageJ. Обчислювали об'ємну частку трабекулярної кістки (BV/TV), товщину трабекули (Tb.Th.) та трабекулярне розділення (Tb.Sp.). Кісткові ділянки кори аналізували за допомогою автоматизованого програмного пакету CTan (Bruker). Площу поперечного перерізу і товщину кіркової кістки розраховували з 20 зрізів, розташованих у двох діафізарних областях: 0,5 мм від дистального відділу головки плечової кістки і в дистальному аспекті дельтоподібної горбистості (n = 6-14).
Атомно-силова мікроскопія.
Механічне випробування властивостей мікромасштабу хряща проводили за допомогою АСМ, як описано раніше. 28,30 Коротко кажучи, щойно розсічені головки плечової кістки були вбудовані в середовище оптимальної температури різання (OCT), і були отримані кріосекції суглобового хряща головки плечової кістки товщиною 5 мкм. Зрізи ненадовго розморожували та імунологічно фарбували на колаген VI як маркер PCM. Коротко, зрізи промивали у PBS, блокували у 10% нормальній козячій сироватці та інкубували з афінним очищеним кролячим поліклональним колагеном типу VI антитіл (Fitzgerald Industries, Acton, MA), розведеним 1: 200 у розчині блокування протягом 1 години. Зрізи промивали PBS і фарбували кон’югованим козячим анти-кролячим антитілом AlexaFluor 488, розведеним при 1: 200 в блокувальному розчині (Abcam, Cambridge, MA). Зрізи витримували в PBS до аналізу для збереження гідратації. Місцевий механічний модуль розраховували за допомогою AFM (MFP-3D, Asylum Research, Санта-Барбара, Каліфорнія). Хрящову тканину досліджували за допомогою кремнієвої консолі (k
5,4 Н/м; Novascan Technologies, Ames, IA) із боросилікатним сферичним індентором діаметром 5 мкм, який калібрували щодня. Регіони інтересів, що охоплюють один хондроцит, були ідентифіковані за допомогою флуоресцентної мікроскопії і розташовані приблизно на 1-2 клітини від зовнішніх країв зрізів, щоб уникнути крайових артефактів, залишаючись поза глибокозоновим хрящем і субхондральної кісткою. Область аналізу AFM становила 10 мкм 2, а відступ проводили кожні 0,5 мкм, щоб отримати загальну кількість 400 відступів на область. Зразок був вдавлений із швидкістю 10 мкм/с, оскільки попередні дослідження показали незначні або зовсім не змінювали значення модулів для швидкостей відступу між 5 і 25 мкм/с. 31 Відступ продовжували, поки не було досягнуто зусилля спрацьовування, 300 нН.