Зовнішньоклітинна регульована сигналом ізоформа ERK1 кінази спеціально необхідна для in vitro та In
Анотація
На сьогодні жоден доказ in vitro не продемонстрував диференціальної ролі для двох основних ізоформ шляху ERK (ERK1 та -2), і вони активуються тими самими подразниками. Однак інвалідування ERK1 або -2 in vivo призводить до різних фенотипів, демонструючи різну роль для двох ізоформ. Ембріони мишей, яким не вистачає ERK2, гинуть внутрішньоутробно до 8,5 дня через дефект розвитку трофобласта та мезодерми (10,11). Навпаки, миші ERK1 -/- життєздатні та плодючі; вони мають неповноцінне дозрівання тимоцитів (12) і посилену довготривалу пам’ять (13).
Використовуючи ERK1 -/- тварин (12), ми вивчали участь цієї ізоформи в адипогенезі in vivo та in vitro. Порушення гена ERK1 змінює розвиток жирової тканини у мишей на нормальному харчуванні та призводить до стійкості до ожиріння, спричиненого дієтою. Ми показуємо, що фібробласти та преадипоцити мишачих ембріонів, виділені із дорослої жирової тканини мишей ERK1 -/-, мали порушення адипогенезу. Ми представляємо докази того, що цей дефект можна пояснити специфічною відсутністю ERK1, оскільки залишковий адипогенез клітин ERK1 -/- не зазнає впливу U0126, дуже потужного та специфічного інгібітора MEK. Отже, аналіз ERK1 -/- тварин та клітин чітко пов'язує порушену диференціацію адипоцитів зі зниженим ожирінням та стійкістю до ожиріння, спричиненого дієтою.
ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ
Ми генерували мишей ERK1 -/- з гетерозигот, випущених із шести зворотних схрещувань із тваринами C57BL/6, як описано раніше (12), і контроль надходив з того самого зворотного кросингу. Мишей утримували за 12-годинним графіком світло/темно і мали вільний доступ до води та їжі. З високим вмістом жиру (45% жиру, 35% вуглеводів і 20% білків) та стандартну дієту (10% жиру, 70% вуглеводів і 20% білків) було придбано в SAFE (Epinay/Orge, Франція). Експерименти проводились відповідно до стандартних етичних правил (рекомендацій Європейського Союзу щодо догляду за тваринами в лабораторіях) та були схвалені Медичним факультетом етичного комітету університету Ніцца-Софія Антиполіс.
Клітини та диференціація адипоцитів.
Ембріональні фібробласти мишей готували на 14 день посткойтуму, як описано раніше (14). Преадипоцити з дорослої тканини виділяли з підшкірно-жирових подушечок 8-тижневих мишей (15). Потім 2-денні постконфлюентні клітини обробляли протягом 48 год коктейлем для диференціації адипоцитів, що містив 5 мкг/мл інсуліну, 0,25 мкмоль/л дексаметазону, 0,5 ммоль/л IBMX (3-ізобутил-1-метилксантин) і 10 мкмоль/л тіазолідиндіон. Потім середовище замінювали протягом 6 днів модифікованим Дульбекко середовищем Eagle лише інсуліном та тіазолідиндіоном. Накопичення тригліцеридів вимірювали за допомогою набору (Triglyceride 100; ABX Diagnostics, Монпельє, Франція). Активність гліцерол-6-фосфатдегідрогенази вимірювали, як описано (16).
Кількісна ПЛР в режимі реального часу.
Аналіз експресії генів проводили за допомогою реагентів ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) та SYBR Green (Eurogentec, Seraing, Бельгія). кДНК синтезували з 2 мкг загальної РНК за допомогою зворотної транскриптази Superscript II (Invitrogen). Набір грунтовок був розроблений відповідно до програмного забезпечення виробника. Зразки містили 1 × SYBR Green Master Mix, праймери 0,5 мкмоль/л та 1/50 синтезованої кДНК в об’ємі 25 мкл. Умови ПЛР були такими: 10 хв при 95 ° С, потім 40 циклів по 15 с при 94 ° С, 30 с при 60 ° С і 1 хв при 72 ° С. Ми використовували 36B4 як внутрішній контроль.
Метаболічні дослідження.
Тести на толерантність до глюкози та інсуліну проводили на тваринах віком від 13 до 14 тижнів через 7 тижнів після початку дієти. Глюкозу (2 г/кг) та інсулін (0,75 МО/кг) вводили внутрішньочеревно ін’єкційно мишам, що прокинулись. Зразки крові відбирали з хвостової вени в зазначений час, і глікемію визначали за допомогою біохімічного аналізу (Glucose PAP 250; ABX Diagnostics) та активних смуг Accu-Check (Roche Diagnostics, Мангейм, Німеччина). Кількісне визначення тригліцеридів та вільних жирних кислот проводили з використанням біохімічних наборів Triglycerides 100 (ABX Diagnostics) та NEFA-C (Wako Chemicals, Neuss, Germany).
Витрати енергії, коефіцієнт дихання та рухова активність.
Мишей поміщали на 22 год у метаболічну клітку, підключену до розімкнутої системи непрямої калориметрії, з потоком повітря, налаштованим на 0,5 л/хв. Температура в метаболічній клітці (24 ± 1 ° C) була стабільною і контролювалась протягом усього експерименту. Споживання кисню та вироблення вуглекислого газу реєстрували з інтервалом у 10 с, використовуючи програму збору даних за допомогою комп’ютера. Комп’ютерна обробка дихальних обмінів та сигналів спонтанної активності дозволила обчислити ту частину загальної швидкості метаболізму, яка приділяється енергетичним витратам діяльності, і таким чином (шляхом постійного вилучення енергії, витраченої на активність) для обчислення метаболізму спокою цих спокою. миші, що вільно рухаються (17). Мишей утримували в метаболічній клітці о 1000 год без їжі, але з водою. Витрати енергії в спокої після поглинання (еквівалентно базальному метаболізму) вимірювали між 1600 та 1800 год. Через 1800 год мишам давали 1 г звичайної дієти з високим вмістом жиру, а термогенну реакцію на годування (метаболізм та коефіцієнт дихання [RQ]) обчислювали протягом 8 год як збільшення обміну речовин та рівня рівня QQ вище вихідних рівнів перед їжею.
Вимірювання активації ERK.
Екстракти тканин готували з використанням буфера для лізису (9) та аналізували вестерн-блот, використовуючи антитіла проти ERK, фосфорильованого на Thr202/Tyr204 (Cell Signaling Technology) та загальної ERK (Santa Cruz).
РЕЗУЛЬТАТИ
Миші ERK1 -/- мають знижене ожиріння порівняно з тваринами дикого типу.
Дієта з високим вмістом жиру стимулює діяльність ERK в білій жировій тканині.
Щоб дослідити роль шляху ERK у розвитку ожиріння, мишей піддавали дієті з високим вмістом жиру (45% загальної кількості калорій надходить з жиру). Ми запитали, чи дієта з високим вмістом жиру викликала активацію шляху ERK у білій жировій тканині, печінці та м’язах. Як показано на рис. 2 (а дані не показані), дієта з високим вмістом жиру не впливала на експресію ERK1 та -2 у трьох тканинах. Крім того, активність ERK не змінюється в печінці (рис. 2А) та м’язах (дані не наведені) за режиму гіперкалорії. На відміну від цього, загальна активність ERK була більш ніж утричі вищою у білій жировій тканині мишей з високим вмістом жиру у порівнянні з тваринами, які перебувають на стандартній дієті (рис. 2B). Цікаво, що адипоцити пацієнтів із ожирінням із діабетом 2 типу мають вищу активність ERK, ніж контрольні пацієнти (18), що свідчить про важливу кореляцію між підвищеною активністю ERK та ожирінням.
Миші з дефіцитом ERK1 стійкі до ожиріння, спричиненого дієтою, і чутливіші до інсуліну.
Щоб визначити, чи запобігає інвалідування ERK1 запобіганню ожирінню, ми проаналізували частоту дієти з високим вмістом жиру на мишах дикого типу та на нокауті. Як і очікувалося, контрольні миші стали помітно ожиріти на дієті з високим вмістом жиру порівняно з однокласниками, які їли на звичайній дієті (10% від загальної кількості калорій з жиру). На противагу цьому, у мишей ERK1 -/- не спостерігалося ожиріння (рис. 3А). Дійсно, на дієті з високим вмістом жиру середній приріст ваги за тиждень був значно вищим у контрольних мишей, ніж у мишей ERK1 -/- (2,9 ± 0,4 проти 1,7 ± 0,3 г/тиждень відповідно; Р -/- тварини з високим жирова дієта, пахові пахвові жирові прокладки та товщина підшкірного жиру були зменшені на 51 та 30% відповідно (рис. 3B). Цікаво, що ми не помітили різниці у вазі епідидимальної жирової прокладки при дієті з високим вмістом жиру, що свідчить про те, що залежно від місця депо, відсутність ERK1 може впливати на розвиток жирової тканини по-різному. Або, оскільки інвалідація ERK1 не повністю блокувала розвиток жирової тканини, ми не можемо виключити, що епідидимальні жирові прокладки, але жодне інше депо не досягло свого максимального розвитку як в дикому типі і мишей ERK1 -/-. Як спостерігали для мишей на стандартній дієті, різниці в споживанні їжі не спостерігалося між мишами ERK1 -/- та ERK1 +/+ на дієті з високим вмістом жиру (дані не наведені).