BRI2 (ITM2b) інгібує осадження β у природних умовах
Чжунсу Кім
Кафедри 1 Неврології та
Віктор М. Міллер
Кафедри 1 Неврології та
Йона Левітес
Кафедри 1 Неврології та
Карен Янсен Вест
Кафедри 1 Неврології та
Крейг В. Цвізінський
Кафедри 1 Неврології та
Бренда Д. Мур
Кафедри 1 Неврології та
Фредрік Дж. Трондл
Кафедри 1 Неврології та
Маралісса Бан
Кафедри 1 Неврології та
Крістоф Вербек
Кафедри 1 Неврології та
Роберт В. Прайс
Кафедри 1 Неврології та
Ліза Смітсон
Кафедри 1 Неврології та
Лейлані Сонода
Кафедри 1 Неврології та
Кейлі Вагг
Кафедри 1 Неврології та
Віджаярагаван Рангачарі
Кафедри 1 Неврології та
Фангген Цзоу
Кафедри 1 Неврології та
Стівен Г. Юнкін
Кафедри 1 Неврології та
Ніл Графф-Редфорд
2 Неврологія, Медичний коледж клініки Майо, клініка Майо Джексонвілл, Джексонвілл, Флорида 32224
Денніс Діксон
Кафедри 1 Неврології та
Террон Розенберрі
Кафедри 1 Неврології та
Тодд Е. Голде
Кафедри 1 Неврології та
Анотація
Аналіз біологічних ефектів мутацій у генах BRI2 (ITM2b) та білку-попередника амілоїду β (APP) підтверджує гіпотезу про те, що мозкове накопичення амілоїдогенних пептидів у сімейних британських та сімейних данських деменціях та хвороба Альцгеймера (AD) пов'язана з нейродегенерацією. Ми використовували соматичну трансгенну технологію мозку для експресії трансгенів BRI2 та BRI2-Aβ1–40 у моделях мишей APP. Експресія BRI2-Aβ1-40 імітує супресивний ефект, який раніше спостерігався із застосуванням звичайних трансгенних методів, додатково підтверджуючи соматичну методологію трансгенного мозку. Несподівано ми також виявили, що експресія людського BRI2 дикого типу зменшує відкладення мозкового Aβ на моделі миші AD. Додаткові дані вказують на те, що пептид 23aa, Bri23, виділений з BRI2 звичайною обробкою, присутній у лікворі CSF, інгібує агрегацію Aβ in vitro та опосередковує його антиамілоїдогенну дію in vivo. Ці дослідження демонструють, що BRI2 є новим медіатором відкладення Aβ in vivo.
Вступ
Матеріали і методи
Конструкція та підготовка rAAV1.
rAAV1, що експресує BRI2, BRI2-Aβ1–40, BRI2del244–266, неспецифічний одноланцюговий змінний фрагмент (scFv ns) або посилений зелений флуоресцентний білок (eGFP) під контролем промотору цитомегаловірусу/куриного β-актину (CBA). генерується кальцієво-фосфатною трансфекцією pAM/CBA-pI-WPRE-BGH, цис-плазміди rAAV1 pH21 (допоміжна плазміда AAV1) та pFΔ6 у клітинну лінію HEK293. Про конструкцію rAAV1-scFv ns повідомлялося раніше (Levites et al., 2006b). Через 48 год після трансфекції клітини лізували у присутності 0,5% дезоксихолату натрію та 50 ОД/мл бензонази (Sigma) шляхом повторних раундів заморожування/відтавання при -80 ° C та -20 ° C. Вірус виділяли з використанням розривного градієнта йодиксанолу, а потім спорідненість очищали на колоні HiTrap HQ (GE Healthcare). Зразки елюювали з колонки і буфер обмінювали на PBS за допомогою пристрою для центрифугування Amicon Ultra 100 (Millipore). Геномний титр кожного вірусу визначали за допомогою кількісної ПЛР з використанням ABI 7900 (Applied Biosystems). Зразки вірусної ДНК готували шляхом обробки вірусу ДНКазою I (Invitrogen), нагріванням інактивуючи фермент, а потім перетравлюючи білкову оболонку протеїназою K (Invitrogen) з подальшою другою тепловою інактивацією. Зразки порівнювали зі стандартною кривою перевитої плазміди.
Ін’єкція rAAV1 новонародженим мишам.
Кількісне визначення осадження амілоїдів.
Напівмозги занурення закріплювали у 10% формаліні, потім обробляли для вкладання парафіну. Зрізи тканини мозку (5 мкм) були імунофарбовані анти-тотальним Aβ антитілом [33.1.1; 1: 1000 (Levites et al., 2006a)] на автостайнері DAKO. Кількісне навантаження на бляшки Aβ та кількість S-позитивних бляшок на Тіо визначали кількісно, як повідомлялося раніше (Kim et al., 2007). Було проаналізовано від трьох до шести сагітальних зрізів на мозок з відстанню 50 мкм.
Aβ сендвіч ІФА.
Для ІФ-аналізу мозку Aβ від мишей TgCRND8 гемі-передній мозок гомогенізували у 2% SDS із 1 × сумішшю інгібіторів протеази (Roche), розчиненою у H2O, а потім ультрацентрифугували при 100000 × g протягом 1 години. Нерозчинні у SDS пептиди Aβ екстрагували із застосуванням 70% мурашиної кислоти (FA). Для ІФ-аналізу мозку Aβ від 2-місячних мишей Tg2576 гемі-передній мозок гомогенізували в буфері для аналізу радіоімунопреципітації (0,1% SDS, 0,5% дезоксихолату, 1% Triton X-100, 150 мм NaCl і 50 мм Tris-HCl) та потім ультрацентрифугували при 100000 × g протягом 1 год. Для вимірювання рівня ендогенного мишачого рівня Aβ гемі-передній мозок нетрансгенних послідів мишей TgCRND8, що експресують BRI2, гомогенізували в 0,2% діетиламіновому буфері, що містить 50 м NaCl та 1 × суміш інгібіторів протеази (Roche). Рівні ендогенних мишей Aβ вимірювали за допомогою попередньо затвердженої специфічної для гризунів системи Aβ ELISA, як повідомлялося раніше (Eckman et al., 2006). Для аналізу Aβ плазми крові збирали в пробірки, покриті EDTA, після серцевої пункції. Зразки крові центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв при 4 ° C, а потім плазму аликвотували і зберігали при -80 ° C до використання. Рівні Aβ визначали за допомогою специфічних для кінцевих аналізів ІФА аналізів на кінці Aβ, як описано раніше (Kim et al., 2007).
Мишачий анти-Aβ IgG ІФА.
Щоб перевірити, чи генерують миші відповіді на антитіла до Аβ, титри антитіл до Аβ IgG визначали стандартними методами ІФА, як описано раніше (Das et al., 2001). Коротко, мікропланшетні планшети (Maxi Sorp; Dynatech) покривали агрегованим Aβ42 при 2 мкг/лунку. Після промивання додавали послідовні розведення плазми (розведення 1: 500) та інкубували протягом ночі при 4 ° C. Після змивів PBS/0,1% Tween 20 плазмовий IgG виявляли за допомогою анти-мишачого IgG-антитіла, кон'югованого з HRP (1: 2000; Sigma) та субстратом TMB (KPL).
Вестерн-блот.
Заморожені зразки переднього мозку гомогенізували в 2% SDS-буфері з 1 × сумішшю інгібіторів протеази (Roche). Гомогенат центрифугували при 100000 × g протягом 1 години при 4 ° С. Концентрацію білка в супернатантах визначали за допомогою набору BCA Protein Assay Kit (Pierce). Зразки білка (20 мкг) запускали на гелях Bis-Tris 12% XT (Bio-Rad) з буфером XT-MES або гелях Bis-Tris 4–12% XT (Bio-Rad) з буфером XT-MOPS і переносили на 0,2 мкм мембрани нітроцелюлози. Плямки мікрохвилювали протягом 2 хв у 0,1 м PBS двічі і зондували антитілом 82E1 (анти-Aβ1-16; 1: 1000; IBL), CT20 (анти-APP С-кінцевий 20 аа; 1: 1000; TE Golde) і ITM2b (GenWay). Плямки видаляли і зондували анти-β-актином (1: 1000; Sigma) в якості контролю завантаження. Відносну інтенсивність смуги визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення ImageJ (NIH).