Дефіцит коричневого жиру YY1 активізує експресію секретованих білків, пов’язаних із витратами енергії
Франциско Вердегер
кафедра біології раку, Інститут раку Дани-Фарбер, Гарвардська медична школа, Бостон, штат Массачусетс, США
b Відділ клітинної біології Гарвардської медичної школи, Бостон, штат Массачусетс, США
Меган С. Сустек
кафедра біології раку, Інститут раку Дани-Фарбер, Гарвардська медична школа, Бостон, штат Массачусетс, США
b Відділ клітинної біології Гарвардської медичної школи, Бостон, штат Массачусетс, США
Максиміліан Хеттінг
кафедра біології раку, Інститут раку Дани-Фарбер, Гарвардська медична школа, Бостон, штат Массачусетс, США
b Відділ клітинної біології Гарвардської медичної школи, Бостон, штат Массачусетс, США
c Медичний факультет Ахенського університету RWTH, Аахен, Німеччина
Шарон М. Блетлер
кафедра біології раку, Інститут раку Дани-Фарбер, Гарвардська медична школа, Бостон, штат Массачусетс, США
b Відділ клітинної біології Гарвардської медичної школи, Бостон, штат Массачусетс, США
Девін Макдональд
кафедра біології раку, Інститут раку Дани-Фарбер, Гарвардська медична школа, Бостон, штат Массачусетс, США
b Відділ клітинної біології Гарвардської медичної школи, Бостон, штат Массачусетс, США
Джоєва Дж. Барроу
кафедра біології раку, Інститут раку Дани-Фарбер, Гарвардська медична школа, Бостон, штат Массачусетс, США
b Відділ клітинної біології Гарвардської медичної школи, Бостон, штат Массачусетс, США
Пер Пугсервер
кафедра біології раку, Інститут раку Дани-Фарбер, Гарвардська медична школа, Бостон, штат Массачусетс, США
b Відділ клітинної біології Гарвардської медичної школи, Бостон, штат Массачусетс, США
Анотація
ВСТУП
Нещодавно було показано, що системні фактори регулюють термогенез коричневої та бежевої жирової тканини, включаючи фактор росту фібробластів 21 (FGF21) (26), морфогенетичний білок кісток 4 (BMP4) (27), BMP7 (28), BMP8b (29), FGF19 (30), фактор диференціації росту 5 (GDF5) (31), натрійуретичні пептиди (32), простагландини (33, 34), фактор росту судинного ендотелію (VEGF) (35), β-аміноізомасляна кислота (BAIBA) (36), метеориноподібний (14) та іризин (37). Ці фактори беруть участь у контролі витрат енергії та маси тіла за допомогою модуляції НДТ або бежевого жиру. У цьому контексті, чи можуть фактори, що секретуються НДТ, сприяти витраті енергії або компенсувати дефектний термогенез НДТ через активацію інших термогенних тканин, включаючи бежеву або білу жирову тканину, недостатньо зрозуміло.
Тут ми повідомляємо, що втрата YY1 в НДТ призводить до сильного придушення експресії мітохондріальних та термогенних генів. Незважаючи на знижену термогенну функцію BAT, миші з дефіцитом YY1 захищені від ожиріння, спричиненого дієтою, і мають активовану термогенну бежеву та білу жирову тканину. Ми показуємо, що YY1 має антагоністичний контроль генів BAT, оскільки він активує гени, пов'язані з адаптивним термогенезом, шляхом активації канонічного термогенного шляху, але пригнічує низку секретованих білків, включаючи FGF21, BMP8b та GDF15, які активують енергію всього тіла витрати.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Експерименти на тваринах.
Всі експерименти та протоколи були схвалені інституційними комітетами з догляду та використання тварин Інституту раку Дани Фарбер або Медичного центру дияконесси Бет Ізраїль. Мишей YY1-Ucp1Cre та YY1-AdipoCre генерували племінними тваринами, у яких містився флоксирований алель YY1 (38), з трансгенними мишами, що експресують Ucp1 Cre (39) або адипонектин Cre рекомбіназу, відповідно (40). Для експериментів з мишами дикого типу миші C57BL/6 віком 8 тижнів були придбані у Taconic Farms. Мишей підтримували на стандартній чау-дієті або 60% дієті з високим вмістом жиру (HFD) (дослідницькі дієти) з 12-годинними циклами. Для експериментів з холодним опроміненням мишей поміщали в інкубатори з температурою 4 ° C або 30 ° C у зазначені моменти часу, а температуру тіла вимірювали ректальним зондом. Для метаболічних досліджень витрати енергії аналізували за допомогою комплексної лабораторної системи моніторингу тварин (Columbus Instruments). Мишей акліматизували протягом 24 годин до того, як проводили вимірювання. Вимірювання магнітно-резонансної томографії (МРТ) цілих мишей проводили на приладі CITI-сканування.
Експресія генів та Вестерн-блот-аналіз.
Загальну РНК з культивованих клітин або тканин очищали, використовуючи TRIzol (Invitrogen) для синтезу кДНК (набір високої ємності ABI). Відносну експресію мРНК визначали кількісно за допомогою кількісної ПЛР (qPCR) із використанням зеленого барвника SYBR (ABI) та специфічних праймерів (дані не наведені). Для вестерн-блоттингу цілоклітинні лізати готували з буфером для аналізу радіоімунопреципітації (RIPA), відокремлювали SDS-PAGE і переносили в мембрани Immobilon-P (Millipore). Для виявлення циркулюючого GDF15 використовували 1 мкл плазми для SDS-PAGE. Були використані такі антитіла: анти-YY1 (Санта-Крус), анти-UCP1 (Abcam), анти-NDUFA9 (Abcam), антисукцинатдегідрогеназа (анти-SDHA) (Abcam), антиаконітаза (Abcam), анти-GDF15 (Abcam), анти-MTCO1 (Abcam), анти-UQCRC2 (Abcam), pCREB (клітинна сигналізація), загальний CREB (клітинна сигналізація) та антитубулін (Millipore).
Коімунопреципітації.
Пул міжлопаткової коричневої жирової тканини від 5 мишей гомогенізували за допомогою моторизованого товкача в 4 мл ядерного ізоляційного буфера (10 мМ HEPES, рН 7,9, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,5 мМ дитиотреїтолу [DTT], повноцінні інгібітори протеази [ Roche]) та інкубували на льоду протягом 10 хв. Ядра гранулювали центрифугуванням при 3200 × g протягом 5 хв і промивали в 4 мл того ж буфера перед центрифугуванням при 3200 × g протягом 5 хв. Потім ядерні таблетки ресуспендували в 600 мкл імунопреципітаційного буфера (0,1% NP-40, 150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 1 мМ ЕДТА, повні інгібітори протеази [Roche]). Двісті мікрограмів білка інкубували з 3 мкг антитіла YY1 (sc1703; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) або кролячого IgG для контролю протягом ночі при 4 ° C з обертанням. Імунокомплекси осаджували магнітними білковими гранулами G (DynaBeads; Invitrogen) під час 1-годинного обертання при 4 ° C. Потім зразки промивали 5 разів у буфері для імунопреципітації. Нарешті зразки кип'ятили, а супернатанти запускали на SDS-PAGE, включаючи вхідні зразки для виявлення вестерн-блот, використовуючи антитіло PGC-1α (Santa Cruz), антитіло YY1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) та ламін B1 (Abcam).
Лінію клітин бурого жиру De2.3 обробляли диметилсульфоксидом (DMSO) або 10 мкМ форсколіном при 10 мкМ протягом 4 год. Ядра безпосередньо виділяли інкубацією гранул клітин з буфером ядерної ізоляції. Той самий протокол застосовувався для коричневої жирової тканини для коімунопреципітації комплексу YY1 – PGC-1α.