Геномна реакція нирки миші на дієту з низьким вмістом фосфатів змінюється при Х-зчепленому

Лабораторія ортопедичних досліджень, Медичний центр Каролінас, Шарлотта, Північна Кароліна 28232-2861

Анотація

Механізм адаптації нирок до дієти з низьким вмістом фосфатів недостатньо вивчений. Чи то Хіп мутація Phex ген блокує цю адаптацію також незрозуміло. Щоб отримати подальше розуміння цього, 5-тижневий нормальний і Хіп мишей годували контрольною (1,0% Р) або низькофосфатною дієтою (0,03% Р) протягом 3-5 днів. Ниркову РНК гібридизували з мікрочипами Affymetrix U74Av2 (5 масивів/група). З 5719 виявлених генів у кожному масиві 290 значно відповіли ( нирка ссавців має змінну швидкість реабсорбції фосфату в нирках, що реагує на зміну рівня фосфатів у їжі (33). Низьке споживання фосфату з дієтою стимулює реабсорбцію (канальцевий максимум, Tm) фосфату та підвищує нирковий синтез 1,25-дигідроксивітаміну D3 (16, 26). Хоча багато відомо про білки, які транспортують фосфатні іони через клітинну мембрану (27), менше відомо про гормони та цитокіни, які регулюють цей процес. Інша область невизначеності - процес, за допомогою якого реабсорбований фосфат перетинає внутрішню клітину.

Для вивчення цієї системи доступні два експериментальні протоколи. Низькофосфатні дієти стимулюватимуть гомеостатичні механізми збереження фосфатів (16, 26). Крім того, мутації втрати функції Phex ген блокує цю адаптацію та пригнічує збереження фосфатів (26). Відомо, що мутації цього гена трапляються у пацієнтів із Х-зчепленою гіпофосфатемією (33) та у Хіп і Gy мутації мишей (8, 13, 37).

У цьому проекті експресію гена мРНК у нирках миші вивчали за технологією мікрочипів ДНК. Ми припустили, що гени, що беруть участь у реакції нирок на зміну споживання фосфатів у їжі, реагуватимуть на стимуляцію дієтою з низьким вмістом фосфатів та/або пригнічення Хіп мутація. 1

1 Американське фізіологічне товариство спонсорувало зустріч у готелі Riverfront Augusta в місті Аугуста, штат Джорджія, 1–4 жовтня 2003 р., Під назвою „Розуміння функції нирок та серцево-судинної системи через фізіологічну геноміку”, організовану Девідом Поллоком з Медичного коледжу штату Джорджія (див. звіт про засідання Морено С та Поллок Д.М. Фізіольна геноміка 16: 178–179, 2004; 10.1152/фізіолгеноміка.00195.2003. http://physiolgenomics.physiology.org/cgi/content/full/16/2/178).

Цей протокол був схвалений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Медичного центру Каролінаса. Нормальна та Х-зв’язана гіпофосфатемічна, Хіп, мишей виводили в нашій колонії на фоні C57BL/6J із запасів, що походять з лабораторії Джексона, Бар-Харбор, штат Мен, як описано раніше (18). Селекціонерів годували Teklad Mouse Breed Diet (W) No. 8626 (Harlan, Madison, WI) та водопровідна вода ad libitum. Дитинчат відлучили у віці 3 тижнів і перевели на дієту для гризунів Teklad (W). 8604 (Харлан). У віці 5 тижнів миші, Хіп [напівжиготний самець (Хіп/ Y) і гетерозиготна самка (Хіп/ +)] та нормальних (дикого типу) мишей самців і самок годували контрольною (1,0% Р, Teklad 86129) або низькофосфатною дієтою (0,03% P, Teklad 86128) протягом 3-5 днів.

Потім тваринам знеболювали, одну капілярну трубку (70 мкл) крові відбирали з орбітальної пазухи та збирали обидві нирки. Нирки заморожували у рідкому азоті та зберігали при -75 ° C. Потім нирки зважували та гомогенізували, а загальну РНК екстрагували TRIzol (GIBCO-BRL; Invitrogen, Gaithersburg, MD) (15). Неорганічний фосфат плазми вимірювали методом Chen et al. (5).

Експериментальний дизайн.

Рівні кількості РНК від трьох мишей, що відповідали генотипу, статі, дієті та часу на дієті, були об’єднані для створення кожної проби для аналізу мікрочипів. Було проведено чотири групи лікування: 1) Звичайні миші годували контрольну дієту, 2) нормальних мишей годували низькофосфатною дієтою, 3) Хіп мишей, які годували контрольну дієту, або 4) Хіп миші годували низькофосфатною дієтою. Було зроблено п’ять повторень з кожним повторенням, що містило по одному зразку з кожної з чотирьох оброблених груп, загалом для 20 незалежних зразків (всього 60 мишей). Кожна копія була підібрана для односемейних дітей, статі (3 копії самців мишей та 2 самки мишей), часу на дієті (3 копії через 5 днів та 2 через 3 дні) та паралельна обробка.

Аналіз мікрочипів.

Зразки обробляли, як описано в Технічному посібнику з аналізу виразів Affymetrix GeneChip (Affymetrix, Санта-Клара, Каліфорнія; Rev. 1, частина № 701021, http://www.affymetrix.com). Підготовка зразка описана тут коротко. Зразки з 30 мкг РНК очищали на колонках RNeasy від Qiagen (Валенсія, Каліфорнія; продукт No 74104), а потім перетворювали на дволанцюгові кДНК за допомогою набору синтетичних кДНК SuperScript з дволанцюговим набором (продукт № 11917-010; Invitrogen, Carlsbad, Каліфорнія). Потім кДНК експресували як мічену біотином кРНК шляхом транскрипції in vitro (IVT) за допомогою набору для маркування транскриптів РНК Enzo (Affymetrix, номер продукту 900182). Кожен зразок додавали bioB, bioC, bioD та cre (Affymetrix, продукт № 900299). Мічена біотином кРНК була фрагментована неферментативно. Фрагментовану кРНК з 20 незалежних зразків гібридизували до 20 мікрочипів мишей U74Av2 (Affymetrix, продукт № 900343) у буфері гібридизації Affymetrix протягом 16 год при 45 ° C. Гібридизовані масиви промивали і фарбували на станції Affymetrix Fluidics 400 для прикріплення флуоресцентних міток до біотину, потім антитіл, мічених біотином, а потім другого фарбування флуоресцентним маркуванням біотину. Кожен масив сканувався двічі сканером Agilent GeneArray G2500A (Agilent Technologies, Пало-Альто, Каліфорнія).